1 Illumina测序接头（Adapters）结构与功能详解

一、接头的基本结构

1. P5/P7序列

2. Index序列（索引/条形码）

3. 测序引物结合位点（R1 SP/R2 SP）

二、各组成部分的具体功能

1. P5/P7序列

• 功能：实现DNA片段与测序芯片（Flowcell）的结合

• 工作原理：
• P5/P7序列能与测序芯片表面的互补序列特异性结合
• 这种结合是后续桥式PCR扩增的基础
• 确保待测DNA片段能稳定固定在测序芯片上

2. Index序列（条形码/barcode）

• 位置分布：
• Index1：与P7接头相连
• Index2：与P5接头相连

• 主要功能：
• 作为文库的特异性标识
• 允许多个样本混合测序（Multiplexing）
• 用于区分不同样本来源的测序数据

• 应用场景：
• 在双端测序（Paired-end sequencing）中尤其重要
• 帮助识别和区分来自同一DNA片段的正反两端序列

3. 测序引物结合位点（R1 SP/R2 SP）

• 功能：提供测序反应的起始位点

• 工作机制：
• 为Read1和Read2测序引物提供特异性结合位置
• 在dNTP和DNA聚合酶存在的条件下
• 启动并支持碱基的逐步延伸反应

illumina测序流程

一、文库制备详细步骤

1. DNA样品质控

• 使用 Nanodrop 和 Qubit 进行定量

• 琼脂糖凝胶电泳检测完整性

• 确保起始 DNA 质量满足要求：
• 浓度 ≥ 50 ng/μL
• OD260/280 比值在 1.8-2.0 之间
• 完整性良好，无明显降解

2. DNA片段化处理

• 物理方法：
• 超声破碎 (Covaris)
• 机械剪切

• 酶切方法：
• 限制性内切酶消化

• 目标片段大小：通常为 300-500bp

• 需进行胶电泳验证片段大小分布

3. 末端修复

1. 末端补平
• 将片段化的 DNA 转换为平末端
• 使用 T4 DNA 聚合酶填补 5'突出端
• 使用 Klenow Fragment 去除 3'突出端

2. 5'磷酸化
• 使用 T4 多核苷酸激酶(PNK)
• 确保 DNA 片段 5'端带有磷酸基团

3. 3'端加 A
• 使用 Klenow Fragment (3'→5' exo-)
• 在平末端 3'端加上单个 A 碱基
• 为接头连接做准备

4. 接头连接

1. 准备工作
• 准备含有 T 突出的接头
• 接头需包含测序引物序列和索引序列

2. 连接反应
• 使用 T4 DNA 连接酶
• 在适当温度下进行连接反应
• 通常 16°C 孵育过夜

5. PCR扩增

1. 扩增参数
• 循环数：通常 4-12 个循环
• 使用高保真酶进行扩增
• 引物特异性结合接头序列

2. 产物纯化
• 琼脂糖凝胶电泳分离
• 或使用磁珠纯化系统
• 去除接头二聚体等副产物

6. 文库质控

1. 浓度测定
• Qubit 定量
• qPCR 绝对定量

2. 片段大小检测
• Bioanalyzer 或 Fragment Analyzer
• 检测文库片段大小分布
• 确认是否存在接头二聚体

3. 质量标准
• 浓度达到要求（通常 >2 nM）
• 片段大小分布均一
• 无明显接头二聚体污染

7. 文库储存

• 将文库分装成小管

• 20°C 或 -80°C 保存

• 避免反复冻融

注意事项

1. 全程使用低吸附管和吸头

2. 严格控制操作环境清洁度

3. 设置阴性对照监控污染

4. 关键步骤需要进行质控

5. 准确记录每个样本的标签信息

二、桥式PCR扩增（Bridge PCR Amplification）

1. 基本原理

2. 芯片表面预处理

1. 表面修饰
• 芯片表面密集固定两种寡核苷酸
• 分别与P5和P7接头序列互补
• 通过共价键牢固结合在芯片表面

2. 空间分布
• 寡核苷酸随机均匀分布
• 密度精确控制
• 确保后续簇的形成不会相互干扰

3. 扩增过程详解

3.1 初始结合

1. 单链化
• 文库DNA变性成单链
• 随机分布在芯片表面

2. 首轮结合
• 文库DNA的一端（P5或P7）
• 与芯片表面互补序列杂交
• 形成稳定的双链结构

3.2 桥式扩增循环

1. 第一轮延伸
• DNA聚合酶起始工作
• 以芯片表面寡核苷酸为引物
• 合成互补链

2. 变性与桥化
• 双链DNA变性分离
• 游离端弯曲形成"桥"结构
• 与邻近的互补寡核苷酸结合

3. 第二轮延伸
• 新的DNA聚合反应开始
• 完成桥式结构的复制
• 形成新的双链DNA

4. 循环扩增
• 上述过程持续进行
• 每个初始分子不断复制
• 在固定位置形成DNA簇

4. DNA簇（Cluster）形成

• 大小：约1微米直径

• 分子数量：约1000个拷贝

• 密度：每平方毫米可达数十万个簇

• 均一性：每个簇内分子完全相同

5. 优化参数

6. 注意事项

1. 质量控制
• 定期检查簇的形成效率
• 监控扩增的均一性
• 评估背景噪音水平

2. 污染防控
• 严格控制环境清洁度
• 避免交叉污染
• 使用高纯度试剂

3. 优化建议
• 根据文库类型调整参数
• 保持反应体系稳定性
• 确保芯片表面清洁

三、边合成边测序（SBS）

1. 测序前准备

2. Read1测序过程

3. Index1测序（i7 Index）

4. Read2测序准备

5. Read2测序

6. Index2测序（可选，i5 Index）

7. 数据处理

8. 质量控制要点

1. 信号质量监控
• 荧光信号强度
• 背景噪音水平
• 信号衰减程度

2. 测序质量评估
• 碱基质量值分布
• 错误率估计
• 测序深度统计

3. 数据完整性检查
• Read1/Read2配对情况
• Index读取准确性
• 数据产出达标情况

参考文献

illumina测序接头类型

在高通量测序技术日益成熟的今天，相信大家或多或少都对文库制备实验有所了解，而文库制备的目的,就是为了在目标DNA序列两端连接上特异的接头，从而能够在测序平台上机测序。那今天，我们就来扒一扒关于Illumina平台文库接头的那些事儿吧。

https://www.zhihu.com/tardis/zm/art/581762955?source_id=1003

1. illumina测序原理 - acmloser - 博客园

本人的生物只有高中且4年没碰的水平,如果涉及生物的笔记没写对请见谅. 1. 一个典型的生物信息分析 我们在做生物信息分析时,常常是有一个目的,比如分析为什么某朵花是红色的.假设我们在做转录组数据分析,流程一般如下图所示: 得到数据后,我们会进行标准分析,得到一些信息比如基因表达信息、突变信息等,这个

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